Wanneer een patholoog weefsel onderzoekt, gebeurt dat meestal aan de hand van flinterdunne, gekleurde plakjes. Die leveren veel detail op, maar tonen slechts een tweedimensionale doorsnede van een klein deel van het weefsel. Onderzoekers van TU Delft en Erasmus MC werken daarom aan een techniek waarmee zij grotere stukken prostaatweefsel zonder kleurstoffen in 3D kunnen bekijken. De eerste 3D beelden van menselijk prostaatweefsel vormen een belangrijke technische mijlpaal.
.

Van zebravis naar prostaatweefsel

“Het begon eigenlijk in 2018 met een promovendus die optische tomografie op zebravissen onderzocht,” vertelt Jeroen Kalkman van de afdeling Imaging Physics aan de TU Delft. Zebravissen zijn een praktisch onderzoeksmodel voor vele ziektes en daardoor interessant om af te beelden. Ze zijn klein genoeg om in hun geheel af te beelden, terwijl hun organen voldoende complexe structuren bevatten om beeldvormingstechniek te ontwikkelen en te verfijnen.

In dezelfde periode onderzocht Martin van Royen in samenwerking met patholoog Arno van Leenders bij de afdeling Pathologie en Klinische Bioinformatica in het Erasmus MC de driedimensionale architectuur van gezond prostaatweefsel en prostaatkanker. Na een lezing van Kalkman raakten de onderzoekers met elkaar in gesprek. Zou de Delftse kennis van optische tomografie ook kunnen worden gebruikt om menselijk prostaatweefsel in 3D te bekijken?

Binnen het Convergence Health & Technology Flagship Convergence Imaging Facility and Innovation Center (CIFIC) kregen de onderzoekers van de TU Delft en Erasmus MC de mogelijkheid om deze techniek samen verder te ontwikkelen.
.

Waarom weefsel in 3D bekijken?

Wanneer een patholoog wil beoordelen of weefsel afwijkende of kwaadaardige cellen bevat, wordt het doorgaans bewerkt, in flinterdunne plakjes gesneden en gekleurd. De gekleurde coupes worden vervolgens onder de microscoop onderzocht. Deze werkwijze vormt al meer dan 150 jaar de basis van de huidige pathologie en levert zeer gedetailleerde informatie op.

“Een dunne coupe laat echter maar één tweedimensionale doorsnede zien, en geeft een beperkt beeld van de weefsel architectuur” legt Martin van Royen uit. “Wij willen juist begrijpen hoe de cellen die normaal de klieren vormen in de prostaat, bij kanker verdeeld liggen in het weefsel, welke vorm deze klieren hebben, hoe ze vertakken en met elkaar verbonden zijn.”

Juist bij prostaatkanker is deze ruimtelijke architectuur belangrijk want pathologen classificeren de kwaadaardigheid van een tumor onder meer aan de hand van groeipatronen van de klieren. Bij het gebruik van dunne plakken kan, afhankelijk van de plaats en richting waarin het weefsel wordt aangesneden,  dezelfde driedimensionale structuur er in het platte vlak anders uitzien. Een 3D-beeld kan aanvullend inzicht geven over de manier waarop een tumor groeit.

.

Nieuwe methode: Optische Diffractie Tomografie

De klassieke manier om een 3D-beeld te krijgen van weefsel is door middel van het afbeelden van een groot aantal afzonderlijke coupes. Het maken, kleuren, afbeelden en digitaal samenvoegen van al die plakjes is echter arbeidsintensief. Bovendien kunnen bij het snijden en reconstrueren kleine vervormingen ontstaan. Daarnaast wordt met deze methode meestal slechts een deel van het totale weefselvolume onderzocht. Een meer recente mogelijkheid is met gebruik van confocale microscopie en fluorescerende kleuringen van optisch transparant gemaakt weefsel.

Optische diffractie tomografie, oftewel ODT, kiest een andere route. De methode gebruikt het verschil in brekingsindex van het weefsel zelf om contrast tussen de verschillende weefstelstructuren te creëren. Daardoor zijn geen kleurstoffen of fluorescerende labels nodig. ODT gebruikt projecties van het doorgelaten licht om een volledig 3D beeld te reconstrueren. Daardoor hoeft het monster niet eerst in een lange reeks coupes te worden verdeeld. Juist die combinatie maakt de techniek interessant: een groter samenhangend weefselvolume kan ook diep in weefsel (3D) worden gebruikt zonder gebruik te maken van kleuringen.

.

Licht als bron van informatie

ODT maakt gebruik van verschillen in de brekingsindex van weefsel. Die brekingsindex bepaalt hoe licht wordt afgeremd en afgebogen wanneer het door een materiaal gaat. Water, vetten, eiwitten en verschillende onderdelen van een cel hebben ieder iets andere optische eigenschappen. Wanneer licht door het weefsel gaat, veranderen daardoor de richting en de fase van de lichtgolf heel subtiel.

.

Om die subtiele verschillen in de brekingsindex te meten, gebruikt de opstelling digitale holografie. Het laserlicht wordt opgesplitst in twee bundels. Eén bundel gaat door het weefsel en de andere dient als referentie. Wanneer de bundels daarna weer worden samengebracht, ontstaat een interferentiepatroon, een digitaal hologram. Daaruit kan worden berekend hoe het weefsel de lichtgolf heeft veranderd.

Eén opname levert nog geen volledig 3D-beeld op. Daarom wordt het weefsel vanuit veel verschillende richtingen gemeten. Algoritmen voegen de duizenden metingen samen tot een driedimensionale reconstructie. Het principe lijkt op dat van een CT-scan: beelden uit verschillende richtingen worden samengevoegd tot een driedimensionale reconstructie. Een CT-scanner gebruikt daarvoor röntgenstraling; ODT gebruikt laserlicht en meet verschillen in brekingsindex op microscopische schaal.

Wat kan de techniek opleveren?

Met de methode zijn inmiddels 3D-beelden gemaakt van prostaatweefsel. Daarmee laat het team zien dat de volledige route van het ophelderen van het weefsel en de optische meting tot de digitale reconstructie technisch werkt.

Met deze techniek kunnen onderzoekers relatief grote structuren in menselijk prostaatweefsel labelvrij en driedimensionaal afbeelden. Daardoor kunnen zij niet alleen een enkele doorsnede bekijken, maar bijvoorbeeld ook onderzoeken hoe structuren door het weefsel lopen en met elkaar verbonden zijn. Daarnaast kunnen eigenschappen zoals vorm, omvang, vertakking en onderlinge samenhang worden gemeten. Op de lange termijn zou dit kunnen bijdragen aan een meer kwantitatieve beoordeling van klinisch weefsel.

Zover is het onderzoek nog niet. De huidige beelden tonen dat de techniek werkt, maar nog niet dat met ODT prostaatkanker zelfstandig kan worden herkend of mogelijk nauwkeuriger  kan classificeren dan de bestaande pathologie.

“Ik zie ODT eerder als een aanvulling dan als een vervanging van de huidige pathologie,” benadrukt Kalkman. “Voor een klinische toepassing is nog uitgebreid onderzoek en validatie nodig.” De onderzoekers zien ODT daarom vooralsnog vooral als een onderzoeksinstrument, maar streven ernaar dat een dergelijke aanpak waarde zal hebben in de kliniek.

.

De volgende stap

De volgende stap is daarom om ODT-beelden van meer patiëntmonsters systematisch te vergelijken met gekleurde coupes en de beoordeling van pathologen. Zo moet duidelijk worden welke groeipatronen in 3D herkenbaar zijn, of normaal en kwaadaardig weefsel betrouwbaar van elkaar kunnen worden onderscheiden en welke aanvullende informatie ODT oplevert. Als de methode in vervolgonderzoek voldoende betrouwbaar en bruikbaar blijkt, zou ODT de bestaande pathologie in de toekomst mogelijk kunnen aanvullen met een driedimensionale blik op weefsel.

.

Betrokken onderzoekers

Het project wordt geleid door Jeroen Kalkman van de afdeling Imaging Physics van TU Delft en Martin van Royen van de afdeling Pathology and Clinical Bioinformatics van Erasmus MC. Vahid Khandan werkte als postdoc aan de ontwikkeling van het ODT-platform. Ook Alim Yolalmaz, Ofir Heymans, Johan Slotman, Jos van Rooij, Gijs Hooghiemstra en uro-patholoog Arno van Leenders zijn bij het onderzoek betrokken.